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        细胞生长的检查方法(二)
        浏览次数:1452发布日期:2016-06-23

        1.检测细胞代谢活性

        检测细胞的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况九州体育app。在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加,而活性的脱氢酶可以使得外源性的四唑盐或者阿尔玛蓝(Alamar blue)还原成为带有颜色还原产物。通过分光光度计或者酶标仪来读取含染料培养基的吸光度,从而衡量细胞的代谢活性,检测细胞增殖的情况九州体育app。

        四种zui常见的四唑盐是:MTT、XTT、MTS和WST1,其还原产物为甲瓒(formazan)。

        (1)四甲基偶氮唑盐法(MTT):MTT商品名为噻唑蓝,是一种黄色的染料。1983年Mosmann建立MTT比色法九州体育app,用于检测细胞存活和增殖九州体育app。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶,甲瓒并沉积在细胞中九州体育app,而死亡的细胞无此功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒九州体育app,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量九州体育app。在一定细胞数量范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比九州体育app九州体育app。MTT可以用于所有细胞类型,但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的,而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSC)中。因此,MTT主要作为终点检测方法九州体育app。另外九州体育app,有研究发现过氧化物会降低MTT测定的准确度,抑制将近95%,的MTT与O2-的反应,MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上九州体育app,而致使检测的结果呈现假阴性。

        (2)二甲氧唑黄比色法(XTT):XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物九州体育app,可被活细胞还原形成水溶性的橘黄色的甲瓒产物,不形成颗粒,可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度,故较MTT法更加快速、简便、敏感。

        但XTT水溶液不稳定九州体育app,需要低温保存,现配现用。由于XTT的代谢产物呈橘黄色九州体育app,故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果。与MTT一样,过氧化物可抑制近95%的XTT与O2-的反应,故对XTT测定的准确度有一定的影响九州体育app。

        (3)内盐法(MTS):MTS是一种新型的MTT类似物。MTs在偶联剂PMS存在的条件下,可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物九州体育app,其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关,可用酶标仪检测。它的优点在于无放射性、快速、安全九州体育app、方便、灵活及特异性强,同时又克服了MTT、XTT的缺点九州体育app。

        (4)四唑单钠盐法(WST-1):WST-1是水溶性四唑盐试剂九州体育app九州体育app,是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下九州体育app,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒九州体育app。细胞增殖越多越快九州体育app,则颜色越深九州体育app;细胞毒性越大,则颜色越浅九州体育app。WST-1是MTT的一种升级替代产品,和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先,MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲瓒不是水溶性的,需要由特定的溶解液来溶解:而WST-1和XTT九州体育app、MTS产生的甲瓒都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。其次,WST-1产生的甲瓒比XTT和MTS产生的甲瓒更易溶解。再次,WST-1比XTT和MTS更加稳定,加入WST-1显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板九州体育app,使检测时间更加灵活,实验结果更加稳定。另外,WST-1和MTT、XTT等相比九州体育app九州体育app,线性范围更宽九州体育app,灵敏度更高。

        (5)Cell countjn譬kit-8(CCK-8):CCK-8试剂中含有WST-8九州体育app。WST-8是近年新开发的一种较WST-1更新的水溶性四唑盐九州体育app,检测原理与WST-1类似,但较WST-1更稳定,灵敏度更高,溶解性更强九州体育app,更易于保存。CCK-8检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比MTT、XTT及MTS更高,尤其适合于悬浮细胞,高通量药物筛选。CCK-8法细胞毒性低,细胞检测后还可重复利用,具有更好的实用性九州体育app,可替代MTT法,具有良好的应用前景。

        (6)阿尔玛蓝法:阿尔玛蓝检测试剂为细胞增殖和细胞毒性检测提供了一种简便、快速、可靠、安全的方法九州体育app。阿尔玛蓝在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性九州体育app,而在还原状态下转变为呈粉红或红色荧光的还原产物,可以用普通分光光度计或荧光光度计进行检测九州体育app,吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。阿尔玛蓝对细胞无毒、无害,不影响细胞代谢、细胞因子分泌、抗体合成等,可以对同一批细胞的生长状态进行连续观察和进一步的实验。

        MTT可以用于所有细胞类型,但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的,而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSO中。因此,MTT主要作为终点检测方法。其他三种盐与阿尔玛蓝一样,都是可溶且无毒的九州体育app。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低,需要添加额外的因子。而WST-1更灵敏有效九州体育app,与其他盐相比能够更快显色。阿尔玛蓝的灵敏度也很高,只要微孔板的孔中有100个细胞它就能够检测到九州体育app。四唑盐和阿尔玛蓝氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究,非常方便。

        2.检测ATP含量

        ATP是细胞能量的直接来源,细胞内的ATP含量受到严格的调控,死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不舍ATP九州体育app,在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。因此,检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。

        ATP检测可以用成色反应九州体育app、荧光、化学发光或同位素等方法实现。目前应用zui广的方法基于萤火虫荧光素酶(催化荧光素氧化,消耗ATP。如果有ATP存在,则荧光素就会发光,发光效率极高,发光量与ATP含量呈很好的线性关系,可以反映细胞内ATP的含量。

        3.活细胞荧光标记

        羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料,CFSE能够轻易穿透细胞膜,在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合九州体育app,水解后的CFSE释放出荧光物质九州体育app,这些共价结合的荧光物分子很少从细胞内脱落。CFSE标记后的细胞用于体内观察可以长达数周。当细胞分裂时,CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中九州体育app,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样,在一个增殖的细胞群体,各连续代细胞的荧光强度呈对数递减,利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

        4.增强标记检测

        增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白九州体育app,利用特异性的单抗来识别这些增殖细胞。例如,在人体细胞中,Ki-67九州体育app九州体育app,PCNA等可以作为细胞增殖的标志九州体育app。但是九州体育app九州体育app,由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。

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